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    • 专利摘要:
    本实用新型提供一种用于富集新型冠状病毒患者体液中冠状病毒的装置，其特征在于，包括：具有阀门的容纳体液的漏斗；能拆卸地安装于漏斗的梢端的滴嘴；设置于滴嘴的下方的废液收集器；以及循环泵，循环泵设置于漏斗与废液收集器之间，使废液收集器中的废液回流至漏斗；滴嘴在内周面上形成有凸台，凸台上载置有用于在体液通过时吸附病毒分子的基片；基片具有多孔网状结构，形成为ACE2修饰的金纳米阵列。本实用新型能以简单的结构快捷地从低病毒载量的体液中得到高载量的病毒样品，从而提高各种检测技术中对COVID‑19患者诊断的准确性，且能在短时间内实现新型冠状病毒和同类冠状病毒的富集，富集效率高、成本低廉且效率大幅提高。
    公开号:CN214334413U
    申请号:CN202022792288.4U
    申请日:2020-11-27
    公开日:2021-10-01
    发明作者:杨勇；林成龙；黄政仁；彭宇思；姚秀敏
    申请人:Shanghai Institute of Ceramics of CAS；
    IPC主号:G01N1-28
    专利说明:
    [n0001] 本实用新型涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种用于富集新型冠状病毒患者体液中冠状病毒的装置。
    [n0002] 2019年由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)导致的一种严重急性呼吸系统综合症大爆发，其原因在于冠状病毒疾病(COVID-19)的全球大流行，目前认为主要的传播途径是暴露的含有SARS-CoV-2病毒的飞沫或体液。因此，应当下公共卫生要求，迫切需要快速准确地识别新出现的SARS-CoV-2病毒株。目前，已从COVID-19患者的痰液、唾液、粪便、血清和尿液中鉴定出SARS-CoV-2，其病毒载量为102-107copies/mL。酶联免疫吸附测定(ELISA)和实时聚合酶链式反应(RT-PCR)分析已用于诊断SARS-CoV-2病毒感染，其中美国疾病预防控制中心RT-PCR分析的检测限(LOD)检测的含量为1000copies/mL。
    [n0003] 目前现有的技术和装置在进行病毒检测时，得到的样品因病人患病成度不同而病毒载量不同，面对低病毒载量的样品时，检测的准确性收到很大限制，比如出现假阴性。而且目前的病毒富集技术和装置，成本高、耗时长，因此面对SARS-CoV-2病毒的爆发或者新型冠状病毒的爆发时，检测工作面临极大压力。
    [n0004] 表面增强拉曼光谱(SERS)是一种高灵敏度光谱分析方法，可以无损检测和识别特征分子的化学结构，具有检测单个生物细胞的能力。然而，COVID-19患者的体液中含有太多其他蛋白质和生物大分子，使表面增强拉曼光谱信号遭受来自其他杂质的干扰，导致信噪比很差。因此，在SERS检测之前有必要准确地从含有SARS-CoV-2病毒的飞沫或受污染的污染物中捕获目标病毒来排除其他杂质信号的干扰。
    [n0005] 冠状病毒的刺突糖蛋白(S蛋白)是疫苗和用于诊断的主要靶标。根据报道宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)具有与SARS-CoV-2S蛋白或SARS-CoV S蛋白特异性结合的能力。
    [n0006] 由此可见，目前急需一种能够快速从从低病毒载量的体液中获得高载量的病毒样品的装置。
    [n0007] 实用新型要解决的问题：
    [n0008] 针对上述问题，本实用新型的目的在于提供一种能从低病毒载量的体液用于富集新型冠状病毒患者体液中冠状病毒的装置。
    [n0009] 解决问题的技术手段：
    [n0010] 本实用新型提供一种用于富集新型冠状病毒患者体液中冠状病毒的装置，其特征在于，包括：具有阀门的容纳体液的漏斗；能拆卸地安装于所述漏斗的梢端的滴嘴；设置于所述滴嘴的下方的废液收集器；以及循环泵，所述循环泵设置于所述漏斗与所述废液收集器之间，使所述废液收集器中的废液回流至所述漏斗；所述滴嘴在内周面上形成有凸台，所述凸台上载置有用于在体液通过时吸附病毒分子的基片；所述基片具有多孔网状结构，形成为ACE2修饰的金纳米阵列。
    [n0011] 根据本实用新型，通过循环泵实现从废液收集器自动向漏斗填充体液，使废液收集器中的废液反复通过吸附病毒分子的基片，能够通过简单可拆卸的结构从低病毒载量的体液中获得高载量的病毒样品。
    [n0012] 也可以是，所述基片通过垫圈载置于所述凸台。
    [n0013] 也可以是，所述体液的病毒载量为80copies/ml以上。
    [n0014] 也可以是，所述循环泵使所述废液收集器中的废液回流至所述漏斗三次以上。
    [n0015] 也可以是，所述漏斗、所述滴嘴和所述废液收集器由玻璃材料构成，所述基片的生长基板为网状硅片，所述垫圈为硅橡胶材料。
    [n0016] 实用新型效果：
    [n0017] 本实用新型能以简单的结构快捷地从低病毒载量的体液中得到高载量的病毒样品，从而提高各种检测技术中对COVID-19患者诊断的准确性，且能在短时间内实现新型冠状病毒(SARS-CoV-2)和同类冠状病毒的富集，富集效率高、成本低廉且效率大幅提高。
    [n0018] 图1是根据本实用新型一实施形态的用于富集新型冠状病毒患者体液中冠状病毒的装置的结构示意图；
    [n0019] 图2是图1所示富集装置中滴嘴的安装结构的结构示意图；
    [n0020] 图3是图1所示富集装置中体液的流路示意图；
    [n0021] 图4是基于判别分析和拉曼测试对基片进行检测的图，(a)是对基片进行判别分析的图；(b)是示出对富集病毒分子后的基片进行拉曼面扫描后得到的病毒信号的图；
    [n0022] 符号说明：
    [n0023] 1、漏斗；
    [n0024] 2、滴嘴；
    [n0025] 21、内螺纹；
    [n0026] 22、垫圈；
    [n0027] 3、SERS基片(基片)；
    [n0028] 4、废液收集器；
    [n0029] 5、循环泵。
    [n0030] 在此公开一种能改善低病毒载量的体液中检测困难的状况的用于富集新型冠状病毒患者体液中冠状病毒的装置(以下简称富集装置)。图1是根据本实用新型一实施形态的富集装置的结构示意图，图2是图1所示富集装置中滴嘴的安装结构的结构示意图，图3是图1所示富集装置中体液的流路示意图。
    [n0031] 如图1所示，本实施形态的富集装置包括漏斗1、安装于漏斗1的梢端的滴嘴2、载置于滴嘴2中的SERS基片3以及设置于漏斗1和滴嘴2的下方的废液收集器4。
    [n0032] 漏斗1例如可以是分液漏斗，主要包括斗体和阀门。斗体是漏斗1的主体，主要用于容纳含有病毒的体液，以上下两端开口的形式构成为能从上方入口注入体液并从下方出口排出体液的结构。在斗体的下方设置有阀门，通过变更阀门的开度能调节从漏斗1排出的体液的流量。在漏斗1的梢端、即斗体的体液排出口上安装有滴嘴2。
    [n0033] 滴嘴2形成为梢端变细的圆筒状，其内部沿轴向形成有流体通道。如图2所示，在滴嘴2的末端沿内周面形成有内螺纹21，与之对应地在上述漏斗1的体液排出口的外周面上形成有外螺纹，由此滴嘴2可拆卸地安装于漏斗1。在将滴嘴2螺合安装于漏斗1的梢端时，体液能从斗体经过滴嘴2内部的流体通道向外部排出。另外，在滴嘴2的末端内侧，在比内螺纹21靠近下方处沿内周面形成有向径向内侧伸出的环状凸台，环状凸台主要用于载置后述的基片3。
    [n0034] 基片3以通过例如橡胶制的垫圈22载置于环状凸台的形式设置于滴嘴2内部，主要用于在体液通过时吸附体液中的病毒分子，从而作为富集元件发挥作用。本实施形态中，基片是通过血管紧张素转换酶2(Angiotensin-converting-enzyme 2，ACE2)修饰的表面增强拉曼基片(SERS Chip)即SERS基片。为了快速通过液体且在透过液体的同时吸附病毒分子，SERS基片3的生长基板可以选用网状硅片，由此制备得到多孔网状结构且经ACE2修饰的金纳米阵列。
    [n0035] 废液收集器4可以是烧杯等器皿，主要用于容纳经由SERS基片3从滴嘴2的梢端排出的废液。
    [n0036] 本实施形态中，富集装置还包括循环泵5。循环泵5设置于漏斗1与废液收集器4之间，通过泵送作用使废液收集器4中收集的废液回流装填至漏斗1。但是也可以不设置循环泵5，而是通过手动或是其他方式将废液收集器4中收集的废液重新装填至漏斗1。
    [n0037] 像这样，在本实施形态中，如图3所示，体液在阀门打开时从漏斗1经由SERS基片3流向滴嘴2，体液在经过SERS基片3时一部分病毒分子吸附于SERS基片3，剩余的体液作为废液滴落至废液收集器4，通过循环泵5的泵送作用将废液收集器4返送至漏斗1，如此循环，使废液多次通过SERS基片3从而使废液中的病毒多次富集在SERS基片3上。
    [n0038] 本实施形态中，漏斗1、滴嘴2和废液收集器4可以由玻璃材料构成，SERS基片3的生长基板可以是网状硅片。
    [n0039] 在使用上述用于富集新型冠状病毒患者体液中冠状病毒的装置时，首先要制备SERS基片3。具体地，首先采用离子束溅射技术溅射金薄膜制备GNAS(Gold Nanoarrays，金纳米阵列)。在制备过程中，硅片选用001晶体取向，电阻率可以是1～10Ω，尺寸可以是(5×5mm，0.5×0.5mm)，在丙酮中超声处理10min。用去离子水洗涤样品，并在氮气气流下烘干。将样品转移到Piranha溶液(食人鱼溶液，由浓硫酸和双氧水配置而成)中1小时，之后再次用去离子水洗涤样品，用氮气干燥，由此完成预清洁。
    [n0040] 接着，采用真空蒸发法在预清洁的硅衬底上沉积Au膜。为了增强离子诱导的纳米结构的形成，在溅射之前在Au膜上沉积一层薄的碳膜。此处，Ar+离子束与Au膜的入射角设置为45°。用直径6cm、能量1keV的离子束在室温下进行4～6min的离子辐照，基础压力为1.5×10-5Pa，工作压力为2×10-2Pa。然后用乙醇除去碳层的残留物。
    [n0041] 之后通过硫醇包覆的金纳米针阵列来使基片酰胺功能化，在此基础上，通过配体交换的方法，n-BuNHCO(C10H20)SH溶解在CH2Cl2中与C6H13S–Au以1:1的摩尔比交换24小时。将试管中的20μg的ACE2-His(2.62mg/mL)溶于1.50mL的PBS溶液中，洗脱至2.0nM。最后将酰胺修饰的SERS基片在ACE2-His PBS溶液中浸泡至少30min，最终完成SERS基片3的制备。
    [n0042] 制备得到SERS基片3后，将SERS基片3用去离子水进行简单的清洗、烘干，然后在垫圈22的保护下将清洗烘干后的SERS基片3载置于滴嘴2的环状凸台。
    [n0043] 然后，将载置有SERS基片3的滴嘴2通过末端形成的内螺纹21螺合于漏斗1梢端的外螺纹部，由此将滴嘴2安装至漏斗1。
    [n0044] 接着，关闭漏斗1的阀门，将病毒载量水平很低(可以低至80copies/mL)的体液注入漏斗1。
    [n0045] 打开漏斗1的活塞，让体液缓慢滴下。滴落液体由废液收集器4收集，待液体低落完毕，关闭漏斗1的活塞。通过循环泵5将废液收集器4中收集的废液再注入至漏斗1。可以循环多次使体液中的病毒分子充分吸附于SERS基片3。
    [n0046] 最后将SERS基片3取下，使用磷酸缓冲盐溶液(PBS)缓冲液冲洗，在自然干燥后进行拉曼测试得到拉曼光谱，通过判别分析(DA)判定体液中时候携带病毒以及病毒种类。以下参照图4简要说明对基片进行的拉曼测试和判别分析。
    [n0047] 图4是基于判别分析和拉曼测试对基片进行检测的图，(a)是对基片进行判别分析的图；(b)是示出对富集病毒分子后的基片进行拉曼面扫描后得到的病毒信号的图。
    [n0048] 本实施形态中，首先以标准的其他病毒(本实施形态中为表达核酸蛋白的病毒即N病毒)阳性尿液(Standard of VN-positive urine)、标准的SARS-CoV-2病毒(即S病毒，表达刺突S蛋白的病毒)阳性尿液(Standard of VS-positive urine)、标准的阴性尿液(Standard of negative urine；即不含病毒尿液)为标样，含有S病毒的尿液作为未知样品，然后对未知样品进行拉曼测试，并对得到的拉曼光谱分别取100个样品点进行数据处理，具体而言，将原始数据导入SPSS软件，使用Fisher判别准则对数据做判别处理，计算未知的各数据点与标样之间的距离，然后根据各样品与标样之间的距离得到样品点的分布如图4的(a)所示。图4的(a)中，含有作为其他病毒的N病毒的尿液的样品点集中分布于图的右上角，不含病毒尿液的样品点集中于图的左侧，而含有SARS-CoV-2病毒的尿液的样品点则集中分布于图的右下方。
    [n0049] 因此，只要对经过上述流程的SERS基片3进行拉曼检测得到如图4中(b)所示的病毒信号，然后对测得的拉曼光谱进行数据处理和判别分析，并与上述多种样品得到的样品点分布进行比较，就能判定用于检测的体液是否为SARS-CoV-2阳性。
    [n0050] 根据本实用新型，在富集装置中通过将ACE2修饰的SERS基片填装于滴嘴，经过多次循环，使体液中可能存在的病毒分子充分吸附到SERS基片上，实现了低载量病毒样品的富集，减少了病毒测试过程的误差。
    [n0051] 下面进一步举例说明实施例以详细说明本实用新型。同样应理解，以下实施例只用于对本实用新型进行进一步说明，不能理解为对本实用新型保护范围的限制。
    [n0052] (实施例1)
    [n0053] 富集装置的结构如图1所示，包括漏斗1、安装于漏斗1的梢端的滴嘴2、载置于滴嘴2中的SERS基片3以及设置于漏斗1和滴嘴2的下方的废液收集器4。
    [n0054] 首先如上所述在面积为0.5mm×0.5mm的硅片上制备SERS基片3。
    [n0055] 将SERS基片3用去离子水进行简单的清洗、烘干，然后在垫圈22的保护下将清洗烘干后的SERS基片3载置于滴嘴2的环状凸台。
    [n0056] 接着将载置有SERS基片3的滴嘴2通过末端形成的内螺纹21螺合于漏斗1梢端的外螺纹部，由此将滴嘴2安装至漏斗1。
    [n0057] 然后关闭漏斗1的阀门，将病毒载量低至80copies/mL(单细胞水平)的200mL尿样作为体液注入漏斗1。
    [n0058] 将漏斗1的活塞打开至最大，让尿液缓慢滴下。滴落尿液由废液收集器4收集，待尿液低落完毕，关闭漏斗1的活塞，此过程耗时为大致30秒左右，通过循环泵5将废液收集器4中收集的废液返送至漏斗1。重复上述过程3次，总耗时小于3分钟。
    [n0059] 最后将SERS基片3取下，使用PBS缓冲液冲洗，在自然干燥后对SERS基片3进行拉曼测试得到拉曼光谱(300个样品点，如图4中(b)所示其中42个点出现病毒型号)。对本实施例得到的拉曼光谱(300个样品点)进行数据处理并使用由上述三种标样构成的标准进行判别，结果如图4中(a)所示显示该42个点分布于下方的SARS-CoV-2区，即上述尿液呈SARS-CoV-2阳性，由此实现了极低病毒载量的尿样中病毒的富集和检测。
    [n0060] 以下进行实施例1中的病毒富集效率的计算。
    [n0061] 如果在200mL病毒载量为80copies/mL的含病毒尿液中所有的病毒分子被SERS芯片吸收，则在最大面积为0.5mm×0.5mm的SERS基片中，在以拉曼测试中心的半径1μm的光斑聚焦窗口中平均分布的病毒颗粒的数量应当为：
    [n0062]
    [n0063] 根据上述判别分析结果，含病毒的成人尿液的病毒载量为80copies/mL，通过对富集装置中的SERS基片3检查一个尿液样品的300个样品点，确定了42个Vs阳性尿点，表明在拉曼聚焦窗口中病毒的实际检测率为42/300＝0.14。因此，GANs尿液中Vs的捕获效率(η1)为：
    [n0064]
    [n0065] 由此可见，通过本富集装置得到的病毒富集效率可以达到70％以上。且该富集装置操作简单，快速稳定，可在3分钟内对200mL的皮摩尔(10-12mol/L)以及更低浓度体液内的病毒进行富集。
    [n0066] 本实用新型的基于ACE2修饰的SERS基片的富集装置能有效地应用于病毒载量为80copies/ml以上的体液中从而得到高载量的病毒样品，不论是对用于传统的ELISA、RT-PCR诊断或SERS光谱检测都具有极其重要的实际应用价值。
    [n0067] 以上的具体实施方式对本实用新型的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应当理解的是，以上仅为本实用新型的一种具体实施方式而已，并不限于本实用新型的保护范围，在不脱离本实用新型的基本特征的宗旨下，本实用新型可体现为多种形式，因此本实用新型中的实施形态是用于说明而非限制，由于本实用新型的范围由权利要求限定而非由说明书限定，而且落在权利要求界定的范围，或其界定的范围的等价范围内的所有变化都应理解为包括在权利要求书中。凡在本实用新型的精神和原则之内的，所做出的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。
    权利要求:
    Claims (5)
    [0001] 1.一种用于富集新型冠状病毒患者体液中冠状病毒的装置，其特征在于，
    包括：
    具有阀门的容纳体液的漏斗；
    能拆卸地安装于所述漏斗的梢端的滴嘴；
    设置于所述滴嘴的下方的废液收集器；以及
    循环泵，所述循环泵设置于所述漏斗与所述废液收集器之间，使所述废液收集器中的废液回流至所述漏斗；
    所述滴嘴在内周面上形成有凸台，所述凸台上载置有用于在体液通过时吸附病毒分子的基片；
    所述基片具有多孔网状结构，形成为ACE2修饰的金纳米阵列。
    [0002] 2.根据权利要求1所述的用于富集新型冠状病毒患者体液中冠状病毒的装置，其特征在于，
    所述基片通过垫圈载置于所述凸台，所述垫圈为硅橡胶材料。
    [0003] 3.根据权利要求1所述的用于富集新型冠状病毒患者体液中冠状病毒的装置，其特征在于，
    所述体液的病毒载量为80copies/ml以上。
    [0004] 4.根据权利要求2中所述的用于富集新型冠状病毒患者体液中冠状病毒的装置，其特征在于，
    所述循环泵使所述废液收集器中的废液回流至所述漏斗三次以上。
    [0005] 5.根据权利要求1所述的用于富集新型冠状病毒患者体液中冠状病毒的装置，其特征在于，
    所述漏斗、所述滴嘴和所述废液收集器由玻璃材料构成，所述基片的生长基板为网状硅片。
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